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        測序結果說明

        測序成功

        正常測序峰圖說明 一個測序反應只能測到1200bp左右。有效堿基(99%準確)在前750bp左右,之后的序列出現寬峰。對于PCR樣品,如果一個反應能測通,那么正常的測序結果就能夠測到PCR終止末端的那個A堿基。(示意圖是1000bp的PCR片段,高保真酶擴增的產物沒有末端那個A)。對于菌樣或者質粒樣品,由于質粒是環狀的,序列在正常情況下,都不會出現終止。
        測序的熒光信號,是從測序引物之后的第一個堿基開始。所以測序得到的序列,是看不到測序引物的。PCR樣品如果測通了,僅能看到另一端引物的反向互補序列。
        測序信號是熒光信號,請不要送任何干擾我們熒光信號的樣品或引物。尤其是熒光定量PCR產物。如果該產物進行常規測序。我們均會正常收費。
        所有的序列文件,都是根據測序峰圖導出的。測序結果的好壞,請根據峰圖判斷。

        菌(質粒)無信號

        菌(質粒)無信號峰圖說明 序列峰圖雜亂無章,測序干擾較大,沒有明顯主峰。(示意圖只提供300bp參考)
        測序原因說明 測序模板與引物無法配對,或者配對能力較差,造成測序信號弱甚至無信號。
        菌樣無信號說明 菌液濃度太低甚至失活,或者載體為低拷貝,造成提取的質粒濃度低,測序無法產生足夠信號。
        載體的信息錯誤,或者載體經過改造,測序引物與模板無法有效結合,造成測序無信號。
        自己附帶引物,請根據測序反應的多少,保證足量引物,且每次附帶新引物,確保引物沒有降解。引物10ul起送。
        解決方法 請提供足夠濃度的新鮮菌液1mL。
        請正確提供載體信息,非常見載體,請提供載體序列及酶切位點。非常見載體,我們公司可能沒有通用引物,或者引物序列不一致,客戶可以提供引物序列。
        若雙向測序,有一端結果正常,另外一端測序結果無信號,可以考慮單向測通。大部分這樣的結果,我們都已針對測序失敗的引物,重新測序過。
        質粒無信號說明 客戶自己提供的質粒濃度太低,造成測序結果信號弱,甚至無信號。實際上多數質粒測序失敗,都是客戶提供的質粒質量不高造成。
        載體的信息錯誤,或者載體經過改造,測序引物與模板無法有效結合,造成測序無信號。
        自己附帶引物,請根據測序反應的多少,保證足量引物,且每次附帶新引物,確保引物沒有降解。引物10ul起送。
        解決方法 自己提供質粒,樣品濃度請大于200ng/ul,低拷貝質粒濃度要求更高。
        請正確提供載體信息,非常見載體,請提供載體序列及酶切位點。非常見載體,我們公司可能沒有通用引物,或者引物序列不一致,客戶可以提供引物序列。
        若雙向測序,有一端結果正常,另外一端測序結果無信號,可以考慮單向測通。大部分這樣的結果,我們都已針對測序失敗的引物,重新測序過。
        典型案例說明 PET系列全部都是低拷貝質粒,測序容易出現信號弱,甚至無信號的情況。
        空載體,如果使用插入片斷的序列作為測序引物,測序結果必然出現無信號的情況。
        我們公司默認的M13F引物是M13-47,并非M13-20。PDONR系列載體沒有M13-47的結合位點,僅有M13-20的結合位點。

        菌(質粒)重疊峰

        菌(質粒)重疊峰峰圖說明 序列峰圖從第一個堿基開始一直到測序結束(有時候是很長一部分重疊,不是全部),測序峰都不是單一峰型,我們稱之重疊峰。有些公司稱之套峰。
        測序原因說明 出現重疊峰,說明上機的模板不止一個。也就是我們測序反應完成之后,產生了不止一個模板。簡單的說,就是產生了不止一條序列。
        菌樣重疊峰說明 接菌可能污染了。這個接菌污染,很有可能是客戶挑單克隆的時候污染了,尤其是抗性未加。并非我們擴大培養的時候造成的污染。
        測序引物和模板不止一個結合位點。通用引物并非只能和載體結合,如果插入片段上有位點,哪怕不是100%結合,也有可能出現重疊峰。
        測序引物降解,尤其是客戶自帶引物容易發生降解。
        解決方法 重新挑取單克隆。如果樣品本身不存在問題,可能是引物和模板不止一個結合位點。請嘗試另外的引物進行測序。
        質粒重疊峰說明 客戶提取質粒過程中,樣品受到污染,造成DNA不止一套。
        測序引物和模板不止一個結合位點。通用引物并非只能和載體結合,如果插入片段上有位點,哪怕不是100%結合,也有可能出現重疊峰。
        測序引物降解,尤其是客戶自帶引物容易發生降解。
        解決方法 重新挑取單克隆。如果樣品本身不存在問題,可能是引物和模板不止一個結合位點。請嘗試另外的引物進行測序。
        典型案例說明 PETDUET系列載體有兩個多克隆位點,T7也就有兩個結合位點了。T7測序肯定重疊峰。
        非單克隆樣品,也是典型的重疊峰型。非單克隆樣品,測序結果僅載體部分不是重疊峰。非單克隆樣品,我們都會正常收費。

        PCR無信號

        PCR無信號峰圖說明 序列峰圖雜亂無章,測序干擾較大,沒有明顯主峰。(示意圖的PCR片段只有280bp)
        測序原因說明 測序模板與引物無法配對,或者配對能力較差,造成測序信號弱甚至無信號。
        PCR未純化樣品測序無信號說明 樣品濃度太低,造成純化之后的模板濃度太低,測序無法產生足夠信號。
        PCR產物送樣量太少。造成DNA總量太少,純化之后無法產生足夠模板,測序信號弱,甚至無信號。以上兩點是PCR失敗的最主要原因。
        PCR片段大于2000bp時,純化效率顯著降低,造成模板濃度不足,測序信號偏弱。
        測序引物與模板沒有結合位點。
        測序引物或者模板,已經發生降解。
        解決方法 請務必提供30uL以上PCR未純化產物。若自行檢測樣品,最多取3uL,檢測到明亮清晰的條帶為準。
        過長的PCR片段,不建議直接測序。請分段擴增,且片段控制在1000bp左右。
        請每次附帶新引物。引物由于稀釋到工作濃度,極易發生降解。長期測序的客戶,請盡量每個星期都能重新送一些引物。引物10uL起送。
        PCR已純化樣品測序無信號說明 樣品濃度太低,測序無法產生足夠信號。
        測序引物與模板沒有結合位點。
        測序引物或者模板,已經發生降解。
        解決方法 自行檢測樣品,最多取3uL,檢測到比較清晰的條帶為準。由于存在運輸上的不確定因素,實際檢測效果,以我們公司電泳檢測為準。
        請每次附帶新引物。引物10uL起送。
        典型案例說明 由于每個客戶的PCR效果都不一樣,PCR的測序成功率是幾種樣品類型中最低的。如果PCR測序效果始終不理想,請考慮TA克隆之后再進行測序。

        PCR重疊峰

        PCR重疊峰峰圖說明 序列峰圖從第一個堿基開始一直到測序結束(有時候是一部分重疊,不是全部),測序峰都不是單一峰型,我們稱之重疊峰。(示意圖的PCR片段只有350bp)
        測序原因說明 出現重疊峰,說明上機的模板不止一個。也就是我們測序反應完成之后,產生了不止一個模板。簡單的說,就是產生了不止一條序列。
        PCR未純化樣品測序重疊峰說明 電泳檢測為單一條帶,但PCR產物實際不是純合產物。
        片段差異小于100bp,無法通過瓊脂糖膠切膠分離。甚至檢測不到非特異性。
        上下游引物混合到同一管進行測序。
        PCR引物與模板有多個結合位點。
        PCR引物已發生降解。
        PCR產物為單引物擴增產物。
        解決方法 PCR重疊峰,說明切膠無法分離條帶。請根據實驗目的,考慮TA克隆之后,再進行測序。
        PCR已純化樣品測序重疊峰說明 PCR產物為混合物,純化并沒有分離各條帶。
        上下游引物混合到同一管進行測序。
        PCR引物與模板有多個結合位點。
        PCR引物已發生降解。
        PCR產物為單引物擴增產物。
        解決方法 嘗試送PCR未純化樣品,我們幫您純化。或者考慮TA克隆之后,再進行測序。
        典型案例說明 幾乎所有的DGGE膠,都無法分離純合條帶。測序結果基本都是重疊峰。
        16srDNA樣品,尤其是27F方向,由于樣品存在突變。測序結果出現重疊峰。且樣品切膠無法分離條帶。
        點突變屬于重疊峰范疇,但是我們會正常收費。

        缺失突變---成功

        缺失突變說明 PCR產物測序時常見的二級結構。菌液、質粒一般不存在,因為挑取單克隆已經去除雜合體。缺失突變樣品均無法測通、拼接。
        測序峰圖說明 序列峰圖從某一個位點之后出現重疊峰。峰圖末端出現不止一個代表PCR終止的‘A峰’。
        測序原因說明 DNA模板并非純合體,或者DNA是混合物。擴增產物出現長度多態性,且切膠無法分離條帶。缺失的序列以及長度,我們都無法準確得知。
        解決方法 缺失突變屬于重疊峰范疇。請將PCR產物TA克隆之后,挑取不止一個單菌落進行測序。
        從反向測序,僅僅會得到長度互補的位點之后出現重疊峰。

        poly結構---成功

        poly結構說明 各種樣品類型均會出現的常見二級結構。測通的樣品,無法通過單向測通這樣的序列。雙向測序有可能測通全長并拼接。
        測序峰圖說明 序列峰圖出現連續單個堿基重復,造成該結構之后的序列出現重疊峰,甚至反應中斷。尤其polyG、polyC,會造成測序反應中斷。
        測序原因說明 poly結構會造成堿基的滑動錯配,導致重疊峰。
        解決方法 poly結構雖然屬于重疊峰范疇,但是無法通過分離單克隆來進行測通。只能嘗試從反方向測到該結構,然后兩個方向的序列嘗試進行拼接。

        高GC---成功

        高GC說明 各種樣品類型均會出現的常見二級結構。
        測序峰圖說明 序列GC含量太高。
        測序原因說明 序列GC含量太高,有可能產生回文結構。造成測序反應后弱,嚴重的情況造成測序反應無法有效延伸,序列中斷。
        解決方法 兩個方向均可以嘗試進行測序,但是我們無法保證一定能測通。

        甲基化序列---成功

        甲基化序列說明 近年來流行的二級結構。尤其是針對線粒體的序列。
        測序峰圖說明 一條序列GT堿基含量很高,互補的序列是AC含量高。GT含量高的這個方向90%會反應中斷。
        測序原因說明 該序列能引起DNA的二級結構,造成測序無法正常延伸,測序反應中斷。
        解決方法 從AC含量高的方向測序,也就是測示意圖的互補鏈,基本上100%能測通這個結構。但是TA克隆的客戶請注意,由于TA克隆的不定向性,我們無法保證一個方向就能測通。做線粒體的客戶請注意,線粒體DNA存在高度甲基化,PCR引物有可能特異性很差,且不是每個方向都適合進行測序。

        發夾結構---成功

        發夾結構說明 非常常見的二級結構。
        測序峰圖說明 序列峰圖從某一個位點之后突然(或逐漸)出現信號減弱、重疊峰、無信號峰型、反應終止。
        測序原因說明 該峰型,我們無法準確告知是哪段序列造成的何種二級結構。但是測序反應由于非正常情況,造成的延伸障礙,使得序列后半部分峰型發生巨大改變。我們都會規定在這種特殊結構之中。
        解決方法 發夾結構的樣品,我們均會按比高GC更高一級的標準嘗試測序,有可能無法單向測通。但是也無法保證從另一個方向能測通這個結構。互補的那個序列有可能存在更嚴重的結構,也有可能和甲基化序列一樣,能輕松通過。

        測序失敗

        測序失敗 我們不進行收費的測序結果。
        測序峰圖說明 測序結果在無信號和正常結果之間,有主峰,但是噪音干擾很大(并非重疊峰型),測序信號弱,或者提前中斷。
        測序原因說明 測序并不是只出現正常收費結果,以及測序無信號的結果。很多測序結果由于樣品濃度太低,測序反應無法正常延伸,序列信號提前減弱,達不到我們的收費標準,我們按測序失敗處理,沒有收費。并不一定是測序技術的問題,有可能是樣品本身不太理想。長時間的運輸、溫度,都有可能使樣品發生降解,造成濃度降低。
        解決方法 測序失敗的樣品,建議重新制備符合要求的樣品。若客戶要求重新測序,如果重新測序對該結果沒有產生任何改善,我們都將針對重新測序正常收費費用。感謝您的理解和支持。
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